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Western blot technique Western blot principes et méthodes

Western blot technique Western blot

Western blot technique Western blot principes et méthodes

La méthode de western blot permet la détection et l’identification de protéines spécifiques dans

un échantillon de cellules.

Pour réaliser une expérience de western blot il faut un anticorps dirigé contre la protéine que

l’on veut étudier capable de se fixer uniquement sur cette protéine d’intérêt.

Etapes de Western blot

Il y a 2 grandes étapes :

– la séparation des protéines selon leur poids moléculaire

– Et la mise en évidence du protéine d’intérêt grâce à l’anticorps .

Méthodes et principes de Western blot

Nous commençons par extraire les protéines des cellules en les séparant

des autres composants cellulaires pour cela nous utilisons une solution qui contient

des détergents mise en contact avec les cellules que l’on veut étudier,

les détergent vont solubiliser les lipides et permettre ainsi de libérer les protéines ,

Ensuite nous mesurons la concentration des protéines dans chaque échantillon ,

cette étape est importante car nous devons préparer des quantités équivalentes

des protéines pour chacun des échantillons ,

technique western blot

L’étape suivante consiste à dénaturer les protéines contenues dans l’échantillon

il s’agit d’ajouter un agent réducteur permettant de déplier les protéines on retrouve les

protéines sous la forme d’une chaîne linéaire des acides animés, la dénaturation va permettre

de séparer les protéines selon leur poids moléculaire et non pas selon leur volume

pour séparer les protéines selon leur poids moléculaire on les fait migrer dans un gel

 se présente comme une couche gélatineuse de quelques millimètres d’épaisseur

maintenu entre 2 plaques de plastique transparents, à une extrémité de gel il y’a

des puits bien séparées et alignés les uns à coté des autres, chaque échantillon est déposé

dans un puits particulier, à coté des échantillons nous ajoutons dans un puits un mélange de

protéines de poids moléculaire connu dit marqueurs de poids moléculaire qui nous servira de

référence pour estimer le poids des protéines de notre échantillon, ces protéines sont colorés pour

pouvoir les visualiser dans le gel, les protéines sont recouvertes d’un détergent chargé négativement nous

appliquons un courant à travers le gel ce qui conduit à la migration des protéines on voit donc

le front de migration pour nos échantillons et la séparation progressif des marqueurs

de poids moléculaire le long du gel, plus la protéine est petite plus elle migre rapidement à travers

les mailles du gel pour poursuivre l’expérience nous transférons les protéines sur une membrane en cellulose

souple et solide plus facile à manipuler que le gel, nous réalisons un sandwich avec

des papiers buvards qui contiennent une solution qui permettra le transfert le gel , la membrane et encore

des papiers buvard pour terminer le sandwich,

technique du western blot

le transfert des protéines du gel vers la membrane

est réalisé grâce à un courant électrique ce transfert concerne la position qu’avait les protéines

dans le gel nous obtenons ainsi une membrane avec l’ensemble des protéines de

nos échantillons séparés en fonction de leur poids moléculaire afin de déterminer si

la protéine d’intérêt est bien présente dans nos échantillons nous utilisons un anticorps

spécifique de cette protéine capable de se fixer uniquement sur cette protéine

la membrane est incubé avec l’anticorps spécifique de la protéine puis

un anticorps secondaire est ajouté, l’anticorps secondaire va se fixer exclusivement sur

l’anticorps primaire qui s’est fixé sur la protéine d’intérêt, l’anticorps secondaire est

couplé à une enzyme en présence de substrat de l’enzyme l’anticorps secondaire aimé de

la lumière comme il est fixé sur un anticorps primaire lui même fixé sur la protéine d’intérêt

l’addition de substrat permet de révéler l’emplacement du deuxième anticorps sur la membrane

donc du premier anticorps et donc celui de la protéine d’intérêt ceci permet la révélation de

bandes sur la membrane correspondant aux emplacements de la protéine on en déduit

la présence ou l’absence de notre protéine dans chacun des échantillons on détermine

la poids moléculaire de la protéine d’intérêt grâce aux marqueurs de poids moléculaire, lorsqu’on

analyse un western blot on a donc 3 informations le nombre de bandes le poids moléculaire de chaque

bande et l’intensité de chaque bande .

Western blot 

En résumé, pour faire un western blot il faut extraire les protéines de nos échantillons et les séparer selon

leur poids moléculaire et les transférés sur une membrane puis révélé leur présence,

il s’agit d’une méthode indirecte de mise en évidence des protéines indirects puisqu’elle repose

sur la révélation non pas de la protéine elle-même mais d’un anticorps qui s’est fixé sur cette protéine

Western blot technique Western blot

Lire aussi : electrophorèse des proteines electrophorese

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